Astrobiyoloji ve CRISPR Teknolojisi

CRISPR-Cas9 teknolojisi, biyoteknoloji dünyasında devrim yaratan bir yenilik olarak karşımıza çıkmaktadır. Bu teknoloji, bakterilerin virüsleri tanıyıp yok etme mekanizmasını taklit ederek DNA üzerinde kesin ve hedeflenmiş değişiklikler yapma imkanı sunar.

CRISPR-Cas9, Jennifer Doudna ve Emmanuelle Charpentier‘in öncülüğünde geliştirilen bu sistem, özellikle tıp ve biyoteknoloji alanlarında geniş uygulama alanı bulmuştur.

Genetik hastalıkların tedavisinden tarımsal biyoteknolojiye, antik DNA rekonstrüksiyonundan astrobiyoloji araştırmalarına kadar birçok alanda çığır açıcı gelişmelere olanak tanımaktadır.

Bu yazıda, CRISPR-Cas9 teknolojisinin tarihçesi, işleyiş mekanizması, son yıllarda kaydedilen önemli gelişmeleri ve astrobiyoteknoloji alanındaki potansiyeli incelenmektedir.

Bakterilerde CRISPR Cas Sistemi

CRISPR-Cas sistemi, bakterilerin adaptif bağışıklık sistemi olarak işlev görür. Bu sistem, bakterilere karşılaştıkları virüsleri tanıma ve yok etme yeteneği kazandırır. CRISPR dizileri, bakterilerin genetik hafızasını temsil ederken, Cas proteinleri yabancı DNA’yı keserek bağışıklık tepkisini gerçekleştirir.

CRISPR dizileri ve spacer’lar, bakterilerin bağışıklık hafızasını oluşturur. Bu hafıza, bakterilerin daha önce maruz kaldıkları virüsleri tanımasını ve hızlıca yanıt vermesini sağlar. Yeni spacer’lar eklenerek, bakteriler sürekli olarak genetik hafızalarını günceller ve yeni enfeksiyonlara karşı korunurlar.

Cas proteinleri, CRISPR sisteminin işlevselliğini sağlar. Bu proteinler, yabancı DNA’yı tanıma ve kesme yeteneğine sahiptir. Cas9 proteini, en yaygın olarak kullanılan Cas proteinlerinden biridir ve hedef DNA’yı keserek genetik düzenlemeyi mümkün kılar.

Cas9, rehber RNA ile birlikte çalışarak, hedef DNA sekansını spesifik olarak tanır ve çift sarmallı DNA’yı keser (Barrangou, 2007).

Resim-1. CRISPR Cas Bağışıklığı (Image Credit: Innovative Genomics Institue)

CRISPR Cas9 Tarihçesi

CRISPR-Cas9 teknolojisi, biyoteknolojide devrim niteliğinde bir araç olarak kabul edilmektedir. Bu teknolojinin keşfi, birkaç önemli bilimsel keşfin birleşimiyle gerçekleşmektedir.

CRISPR-Cas9’un hikayesi, bakteriyel bağışıklık sistemlerinin incelenmesiyle başlamış ve genetik mühendislikte yeni bir çağın başlamasına yol açmıştır. 1987 yılında, Japon araştırmacılar Yoshizumi Ishino ve arkadaşları, E. coli bakterisinin genomunda tekrarlayan DNA dizilimlerini fark etmiştir. Ancak, bu tekrarlayan dizilerin işlevi o dönemde anlaşılamamıştır (Ishino, 1987).

1993 yılında, İspanyol araştırmacı Francisco Mojica, benzer tekrarlayan DNA dizilimlerini diğer bakterilerde de keşfetmiş ve bu dizilerin bakterilerin bağışıklık sisteminin bir parçası olduğunu öne sürmüştür (Mojica, 1993).

Mojica, bu dizilere “CRISPR” (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) adını vermiştir. 2005 yılında, Mojica ve Ruud Jansen, CRISPR dizilerinin yanında bulunan “Cas” genlerini keşfetmişlerdir ve bu genler, CRISPR sisteminin çalışmasında önemli bir rol oynamıştır (Jansen, 2002).

Bu buluş, CRISPR-Cas sisteminin işlevini anlamak için önemli bir adım olmuştur. 2007 yılında, Danisco şirketinde çalışan Philippe Horvath ve arkadaşları, CRISPR-Cas sisteminin bakterilerin virüslere (fajlar) karşı savunma mekanizması olarak çalıştığını deneysel olarak göstermiştir.

Bu, CRISPR sisteminin bir tür “bakteriyel bağışıklık sistemi” olduğu fikrini doğrulamıştır (Barrangou, 2007). CRISPR-Cas9’un gen düzenleme aracı olarak keşfi, Jennifer Doudna ve Emmanuelle Charpentier’in çalışmalarına dayanmaktadır.

2012 yılında, Doudna ve Charpentier, CRISPR-Cas9 sistemini laboratuvarda kullanarak belirli DNA dizilerini kesip düzenleyebileceklerini keşfetmişlerdir (Jinek, 2012). Bu çalışmaları, CRISPR-Cas9’un devrim yaratabilecek bir teknoloji olduğunu ortaya koymuştur.

2013 yılında, Feng Zhang ve George Church liderliğindeki ekipler, CRISPR-Cas9 sistemini memeli hücrelerinde gen düzenleme yapmak için kullanmayı başarmışlardır ve teknolojinin potansiyelini daha da genişletmiştir. Tıbbi araştırmalar ile tedavilerde kullanılmasının yolunu açmıştır (Cong, 2013).

Temel Olarak CRISPR Cas9 Teknolojisinin Mekanizması

CRISPR-Cas9 sistemi üç ana bileşenden oluşur: CRISPR dizileri, Cas9 proteini ve gRNA. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), prokaryotların genomunda bulunan ve yabancı DNA sekanslarını içeren tekrar eden DNA dizileridir.

Bu diziler, bakterilerin daha önce maruz kaldığı virüslerin DNA parçalarını içerir. CRISPR-associated protein 9 (Cas9), bir endonükleazdır, yani DNA’yı kesebilen bir enzimdir. Cas9, hedef DNA’yı keserek genetik düzenlemeye olanak tanır.

Rehber RNA, iki bileşenden oluşur: crRNA (CRISPR RNA) ve tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA). Bu RNA molekülleri, Cas9 proteinine bağlanarak hedef DNA sekansına rehberlik eder. CRISPR dizilerinde depolanan yabancı DNA sekansları (spacer’lar), bir virüs veya plazmid gibi yabancı DNA’nın tanınmasını sağlar.

CRISPR dizileri transkribe edilerek pre-crRNA oluşturur. Pre-crRNA, tracrRNA ile birleşerek rehber RNA (gRNA) kompleksi oluşturur. Bu kompleks, Cas9 proteinine bağlanır ve hedef DNA’yı tanımak için rehberlik eder.

Cas9 proteini, rehber RNA’nın rehberliğinde hedef DNA sekansına bağlanır. Hedef DNA sekansı, rehber RNA tarafından belirlenen spesifik bir sekans olmalıdır. Cas9’un DNA’yı kesebilmesi için hedef DNA’nın yanında bir protospacer bitişik motif (PAM) sekansı bulunmalıdır.

Cas9, hedef DNA sekansını tanıdıktan sonra, çift sarmallı DNA’yı keser. Kesilen DNA, çift zincirli kırık (DSB) oluşturur. Bu kırık, hücrenin DNA onarım mekanizmalarını tetikler (Doudna&Charpentier, 2014).

Resim-2. CRISPR Mekanizması (Image Credit: MRS Bulletin)

Son Yıllarda CRISPR Teknolojisindeki Gelişmeler

2015’den bu yana, CRISPR teknolojisinde birçok yeni keşif ve iyileştirme yapılmıştır. Cas12, CRISPR teknolojisine önemli bir katkı sağlayarak, Cas9’un ötesinde bir kesme mekanizması sunmuştur.

Cas12 proteini, tek bir rehber RNA (crRNA) ile çalışır ve DNA’yı belirli bir yerden keser. Bu protein, farklı DNA hedefleme özellikleri ve daha az off-target etkileri ile öne çıkar (Zetsche, 2015).

Cas13 proteini, RNA hedeflemesi yapan bir CRISPR sistemi olarak tanımlanır. Cas13, RNA moleküllerini keserek gen ekspresyonunu düzenler ve viral RNA’yı hedef alarak çeşitli viral enfeksiyonların tedavisinde potansiyel bir araç olarak kullanılır (Abudayyeh, 2016).

2019 yılında, “prime editing” adı verilen yeni bir CRISPR tabanlı gen düzenleme tekniği geliştirilmiştir. Prime editing, DNA’daki hataları düzeltme kapasitesine sahip daha hassas ve güvenilir bir yöntemdir.

Bu teknik, DNA kesilmeden doğrudan değişiklik yapabilir (Anzalone, 2019). CRISPR-Cas9 teknolojisinde karşılaşılan önemli sorunlardan biri, hedef dışı (off-target) etkileridir. 2016’dan bu yana, çeşitli stratejiler geliştirilerek bu etkilerin azaltılması hedeflenmiştir.

Yüksek doğruluklu Cas9 varyantları (e.g., eSpCas9, HypaCas9) geliştirilmiştir (Slaymaker, 2016) CRISPR teknolojisi, birçok genetik hastalığın tedavisinde kullanılmak üzere klinik denemelere başlamıştır.

2016’dan bu yana, orak hücre anemisi, beta-talasemi, Leber konjenital amaurozu gibi genetik hastalıkların tedavisinde CRISPR-Cas9 ile yapılan klinik denemeler umut verici sonuçlar göstermiştir (Frangoul, 2021).

CRISPR Cas9 Teknolojisinin ISS’te Kullanımı

Geçtiğimiz yıllarda Saccharomyces cerevisiae’nin ekzojen genetik materyalle ilk başarılı dönüşümünü ve uzayda ilk CRISPR-Cas9 genom düzenlenmesini göstermek üzere bir deney gerçekleştirildi.

DNA onarımının tamamen ISS laboratuvarı bünyesinde incelenmesini amaçlayan bir planlama yapıldı. Astronotlar, uzaydaki iyonlaştırıcı radyasyondan kaynaklanan çift zincirli DNA kırıkları riskiyle görev süreçlerinde karşı karşıyadır, deneyin temelde amacı bu mekanizmayı gözlemlemektir. Saccharomyces cerevisiae hücreleri Dünya’da yüksek yoğunlukta büyütülüp pelet haline getirildi ve -80 derecede donduruldu.

Dondurulan hücreler Uluslararası Uzay İstasyonu’na götürüldü ve orada çözdürüldü. ADE2 geni hedefli CRISPR Cas9 aşamalarının ardından hücreler besiyerlerine yerleştirildi ve inkübe edildi.

ADE2 mutantı ve wild type ADE2 kolonileri seçildi ve daha sonra PCR ile çoğaltıldı. Örnekler dizileme yöntemleri ile analiz edilmek üzere yeryüzüne indirildi. Böylece uzay tabanlı olarak CRISPR Cas9 genom düzenlemesinin ilk başarılı kullanımı gerçekleştirildi (Stahl-Rommel,2021).

Antik DNA Rekonstrüksiyonu ve CRISPR Cas9

Antik DNA (aDNA) rekonstrüksiyonu ve astrobiyoloji, yaşamın kökenlerini ve evrimini anlamak için kilit rol oynayan iki önemli bilim dalıdır. Antik DNA, geçmişte yaşamış organizmaların genetik materyalini inceleyerek onların biyolojik özelliklerini ve evrimsel tarihlerini anlamamıza olanak tanır.

Astrobiyoloji, evrendeki yaşamın varlığını, kökenlerini, evrimini ve dağılımını araştıran disiplinler arası bir bilim dalıdır. Mars, astrobiyoloji araştırmaları için önemli bir araştırma konusudur.

Mars’ta eski su yatakları ve göl kalıntıları bulunması, burada geçmişte yaşamın var olabileceğini düşündürmekte ve bilim insanlarını araştırmalar yapmaya sevk etmektedir.

Mars’tan elde edilme olasılığı olan örneklerin DNA analizleri, antik Mars yaşamının izlerini ortaya çıkarabilir. Dünya’daki ekstremofillerin genetik yapılarının incelenmesi, benzer koşullarda başka gezegenlerde yaşamın var olabileceğine dair ipuçları sağlar.

Bu organizmaların genomlarının rekonstrüksiyonu, astrobiyoloji araştırmalarına önemli katkılar sağlar. Bu araştırmaların geliştirilmesi ve uygulanabilirliği açısından ise CRISPR Cas teknolojileri büyük önem taşımaktadır (Grotzinger, 2014).

CRISPR-GEM Projesi

CRISPR teknolojisinin uzay araştırmalarında kullanılmasına yönelik yaklaşımlar gün geçtikçe gelişmekte ve yeni bilimsel çalışmalar ile biyoteknoloji uygulamalarının uzay bilimleri ile kesiştiği bu alan literatürde yerini sağlamlaştırmaktadır.

Türkiye’nin ilk insanlı uzay görevinde, Türk Astronot ve Bilim Misyonu kapsamında gerçekleştirilen 13 bilimsel projeden biri olan CRISPR-GEM bu anlamda verilebilecek güzel bir örnektir.

Tuğçe CELAYİR‘in yürütücülüğünde gerçekleştirilen projede; Uluslararası Uzay İstasyonu’nda mikro yerçekimi koşullarında Arabidopsis thaliana bitkisine agrobacterium yönlendirmeli infiltrasyon olarak bilinen bir teknikle gen aktarımı yapılmış, bu aktarım ile CRISPR müdahalesini gerçekleştirmek üzere özel olarak tasarlanmış plazmid vektör hücre içi seviyede aktif hale getirilmiş ve aktivite sürecindeki bitki dokusu hasat edilerek yeryüzüne geri getirilmiştir.

Yeryüzü kontrol grupları ile uzay deneyi grupları arasında yapılacak moleküler seviyede analizler, CRISPR müdahalesinin bu spesifik konsept altında etkinliğini kantitatif olarak sunacak değerli bir veri şeklinde karşımıza çıkacaktır.